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详述IL-6ELISA试剂盒的实验原理及操作步骤
点击次数:635 发布时间:2017-04-18
   IL-6ELISA试剂盒用于科研检测血清、尿液、组织液中的白介素6浓度水平,或者存在与否。本文上海百蕊来说说IL-6ELISA试剂盒的实验原理和操作步骤。

  IL-6ELISA试剂盒的实验原理:

  IL-6ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中白介素6(IL-6)水平。用纯化的白介素6(IL-6)抗原包被微孔板,制成固相抗原,往包被单抗的微孔中依次加入白介素6(IL-6),再与HRP标记的白介素6(IL-6)抗原结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的白介素6(IL-6)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中白介素6(IL-6)浓度。

  IL-6ELISA试剂盒的操作步骤

  一、试剂准备

  1. 使用前将所有试剂平衡至室温。

  2. 洗液(Wash Buffer):如果浓缩液中已经形成结晶,平衡至室温,并轻轻地摇晃直到结晶完全溶解。加入去离子水或蒸馏水稀释20ml浓缩洗涤液至500ml。

  3. 底物溶液(Substrate Solution):显色试剂A和B应该在使用前15min以等体积混合。避光保存。每孔需要200ul生成的混合物。

  4. IL-6标准品(IL-6 Standard):使用5ml标准稀释液RD5T(Calibrator Diluent RD5T)(适用于细胞培养上清液样本)或标准稀释液RD6F(Calibrator Diluent RD6F)(适用于血清/血浆样本)重新配制IL-6标准品。重新配制的产品为300pg/ml贮存液。稀释前允许将标准品至少轻轻搅拌15min。

  5. 吸取适当的标准稀释液667ul到100pg/ml EP管,500ul稀释液到其它 EP管中。适用贮存液配制一系列的稀释液(如下)。进行下一次转移前充分地混匀各个EP管。没有稀释的标准品作为高标准。适当的标准稀释液作为0标准(0pg/ml)。

  注意:Calibrator Diluent RD6F 包含叠氮化钠(可能与铅和铜的管道)形成爆炸的金属叠氮化合物。处理期间用大量的水冲洗。该盒的终止液为酸溶液。使用时戴眼睛、手、脸和衣服的防护。

  二、测定步骤

  使用前将所有IL-6ELISA试剂盒和样本平衡至室温。推荐所有的样本、标准和对照测定双份。

  1. 准备所有的试剂和工作标准品。

  2. 取下多余的微量培养板条,放回装有干燥剂的锡箔袋中,重新密封。

  3. 每孔加入100ul Assay Diluent RD1W。

  4. 每孔依次加入100ul 标准品、样本和对照。用橡皮条密封。室温孵化2小时。记录测定标准和样本的分布。

  5. 吸弃孔内液体,每孔400ul洗涤液,充分洗涤后完全去除液体。在干净的纸上拍干。反复洗涤4次。

  6. 每孔加入200ul IL-6 Conjugate。用新的橡皮膏条密封。室温温浴2小时。

  7. 重复步骤5。

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