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百蕊生物:NADH氧化酶试剂盒产品介绍
点击次数:714 发布时间:2014-11-12

NADH氧化酶NADH oxidaseNOX试剂盒说明书

测定意义:

NOXEC 1.6.99.3)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,可在氧气存在下,直接将NADH氧化为NAD。该酶不仅参与NAD的再生,而且与免疫反应密切相关。

测定原理:

NOX能够将NADH氧化为NADNADH的氧化与2,6二氯酚靛蓝(DCPIP)的还原相偶联,蓝色的DCPIP被还原为无色的DCPIP,在600nm下测定蓝色DCPIP的还原速率计算出NADH氧化酶活性的大小。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰、蒸馏水

试剂的组成和配制:

试剂一:液体50mL×1瓶,-20保存。

试剂二:液体10mL×1瓶,-20保存。

试剂三:液体1mL×1瓶,-20保存。

试剂四:液体50mL×1瓶,4保存。

试剂五:液体6 mL×1瓶,4保存。

试剂六粉剂×2瓶,-20保存;临用前每瓶加入5mL双蒸水,用不完的试剂仍-20℃保存。

样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

  • 准确称取0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一和10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
  • 将匀浆600g4离心5min
  • 将上清液移至另一离心管中,11100g4离心10min
  • 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的NOX(此步可选做)。
  • 沉淀即为线粒体,加入200uL试剂二和2uL 试剂三,超声波破碎(功率20%,超声3s,间隔10秒,重复30次),用于NOX活性测定。

操作表:

试剂名称(μL

测定管

试剂四

700

试剂五

100

样本

40

蒸馏水

 

混匀后,37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴5min

试剂六

160

将上述试剂按顺序在1mL玻璃比色皿中操作,加入试剂六后立即混匀,同时开始计时,600nm波长下记录20秒时的初始吸光度A1,迅速将比色皿连同反应液一起放入37(哺乳动物)或25(其它物种)水浴中,准确反应1分钟。迅速取出比色皿并擦干,记录120秒时的吸光度A2。计算ΔA=A1-A2

NOX活力单位的计算

1、组织中NOX活力的计算:

1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织在反应体系中每分钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。

NOXU/mg prot=反应总体积(1000μL÷样本体积(40μL÷0.01 ×ΔA÷蛋白浓度(mg/mL=2500×ΔA÷蛋白浓度(mg/mL

2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。

NOXU/g 鲜重)=反应总体积(1000μL÷样本体积(40μL÷0.01 ×ΔA÷样本鲜重(g/mL=2500×ΔA÷样本鲜重(g/mL

2、细菌或培养细胞中NOX活力的计算:

1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义mg组织在反应体系中每分钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。

NOXU/mg prot=反应总体积(1000μL÷样本体积(40μL÷0.01 ×ΔA÷蛋白浓度(mg/mL=2500×ΔA÷蛋白浓度(mg/mL

2)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。

NOXU/104 cell=反应总体积(1000μL÷样本体积(40μL÷0.01 ×ΔA÷细菌或细胞密度(104 cell /mL=2500×ΔA÷细菌或细胞密度(104 cell /mL

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