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上海百蕊生物技术指导之巨噬细胞的分离
点击次数:710 发布时间:2016-02-22

 一、从小鼠、豚鼠或家兔腹腔中分离巨噬细胞

  1.取6周左右的小鼠(或600克左右的豚鼠,或3公斤左右的家兔),剃去腹部的毛并消毒。腹腔注射1ml(豚鼠20ml,家兔200ml)无菌的液体石蜡或巯基乙酸肉汤或4%淀粉肉汤。3~4天以后收集腹腔细胞。

  2.如要收集腹腔静置巨噬细胞,不注射刺激物,直接从这一步开始。放血处死动物,以减少腹腔中的红细胞。消毒腹部,沿腹中线注入3~4ml(豚鼠20~40ml,家兔50~70ml)冰中预冷的无菌PBS-H(含10U/ml肝素和10%小牛血清的PBS)。轻轻按摩腹部5分钟。

  3.以下均无菌操作。剪开腹壁,用吸管吸出渗出液,再用同样容量的预冷PBS-H冲洗腹腔2~3次。合并渗出液于离心管中,4℃离心250×g 10分钟,去上清液。

  4.用预冷的RPMI-1640培养液洗涤细胞3次,每次4℃离心250×g 10分钟,去上清液。用预冷的适量RPMI-1640培养液悬浮细胞,台盼蓝染色计数细胞并决定细胞活力。

  二、家兔肺泡巨噬细胞的分离和纯化

  1.取2~3公斤重的家兔,耳缘静脉注射10ml空气处死动物或注射2ml(含130mg)戊巴比妥麻醉动物。仰卧固定,消毒胸部,剪开胸壁。以下过程注意无菌操作。小心从环状软骨下方剪下气管,分离心脏和血管,取出肺,剪去脂肪和结缔组织。用无菌纱布小心擦净肺表面,称重。

  2.分离肺泡巨噬细胞:用夹子夹住气管,使肺悬空。向气管中注射40ml无菌的冷生理盐水,让生理盐水进入全部肺泡。用镊子提起气管,从夹子下面剪断气管,将肺中的液体倒入离心管中。再用同样方法,用40ml无菌冷生理盐水冲洗肺泡,合并浸出液,置4℃。

  3.分离肺组织中的巨噬细胞:取出肺泡巨噬细胞后,剪去气管,将肺组织放在有冷RPMI-1640培养液的平皿中。平皿置冰上,用吸满冷RPMI-1640培养液的20ml注射器接23号针头,一边灌注一边用针头梳离肺组织,直到肺组织与支气管树全部分离。使肺组织通过00目的钢丝网,分离单个细胞。

  4.以下过程均在4℃中进行。分别处理肺泡巨噬细胞和肺组织中的巨噬细胞:离心200×g 10分钟,去上清液。轻弹试管,悬浮细胞,加入10ml低渗液(20mmol/L Tris, 0.75%氯化铵,pH7.4),37℃处理3~5分钟,溶解红细胞。红细胞通常分别占肺泡巨噬细胞和组织巨噬细胞的1%和10%。也可以不用低渗处理,直接在淋巴细胞分离液上分离巨噬细胞。

  5.离心200×g 10分钟,去上清液。用RPMI-1640培养液洗涤细胞一次。将细胞悬液加在淋巴细胞分离液(比重1.077)上,离心400×g 20分钟,收集交界面的巨噬细胞。弃去沉淀的死细胞和红细胞。

  6.用RPMI-1640培养液洗涤巨噬细胞2次。台盼蓝染色检测细胞活力和细胞数,将细胞配成所需浓度。此时巨噬细胞活力可达90%以上,巨噬细胞占全部细胞的90%以上。

  三、从小鼠脾脏、胸腺和骨髓中分离巨噬细胞

  1.用外科方法无菌摘取小鼠脾脏和胸腺,置于盛有预冷RPMI-1640培养液(含1%小牛血清)的平皿中,剪去结缔组织和脂肪。用无菌注射器芯将脾脏或胸腺挤压通过200目的钢丝网,获得单个细胞。

  2.离心200×g 10分钟,去上清液。用含1%小牛血清的RPMI-1640培养液将细胞配成约1×108~5×108/ml。

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