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western blot 常见问题及解决办法
点击次数:798 发布时间:2017-03-08

我们在做WB时zui常遇到的问题也是惊人的相似——样品漂浮、蛋白条带扭曲(无法准确判断蛋白分子量)、转膜后看不到带蓝色或橙色的指示条带、抗体孵育不均匀导致曝光度差异很大(依然是会影响到蛋白表达量的估算)。
 
这些问题其实都或多或少与样品前处理有关。也就是说,我们完全可以通过优化样品处理手法,以及经验累积,来获得完美的WB结果。

1.出现样品漂浮怎么办??

原因分析:样品中含有未除净的溶剂或杂质,其密度比电泳缓冲液小

解决办法:处理组织或菌体时,需充分分散或裂解,确保目的蛋白尽可能的释放;
热处理粗样时,确保升温迅速,并且金属浴或水温的实际温度达到100℃(在海拔较高处水的沸腾不能确保温度);
离心的转速和时间足够;
吸取上清液时尽量不要碰到中间层

 

2.蛋白条带出现扭曲怎么办?

原因分析:分离胶的浓度与蛋白分子量不对应;灌胶时间过长或过短,导致丙烯酰胺的交联度不均匀

解决办法:根据目的蛋白的分子量选择正确的分离胶浓度;
制备分离胶与浓缩胶时,应保证缓冲液母液的正确稀释,以及各组分的充分混匀(仅用移液器吹吸是不够的,zui好可以迅速用磁力搅拌器进行混匀)
 

3.转膜后没有指示条带怎么办?

原因分析:如果此时SDS-PAGE胶上也没有指示剂,则表明转膜时间过长,蛋白穿膜(此时就没有再继续做下去的必要了)

解决办法:注意控制转膜时间;
电泳液反复使用也可能导致转膜失败

4.抗体孵育不均匀怎么办?

原因分析:孵育时振荡摇床转速过快,或是混匀直径不够,导致孵育不充分或不均匀

解决方法:确保摇床可以在50 rpm稳定运行;选择振荡直径在5~10 mm范围内的摇床
 


 

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